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凡人修炼脂质体秘籍4----胆固醇篇

发布时间:2021-12-21

上篇讲到脂质体辅料总览,磷脂类的辅料种类很多,我们将在后面的篇章具体描述。实际上脂质体的关键辅料只有两类,磷脂类和胆固醇。制备脂质体,胆固醇是必不可少的辅料,除了温敏脂质体,为了降低相变温度时脂质体的稳定性,迅速释放药物,可不添加胆固醇。本篇主要介绍胆固醇的理化性质,制造及应用。

1.脂质体制剂,为什么胆固醇必不可少

胆固醇属于两亲物质,同时具有亲油和亲水两种基团,但是其亲油性较亲水性强,与磷脂相互作用形成脂质体时可嵌入到磷脂分子之间,调节膜结构及性质,提高脂质体功能性。此外,还可调节磷脂双分子层膜的流动性,使膜通透性降低,减少药物渗漏;可使脂膜维持一定柔韧性,增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力;还能对磷脂的氧化有一定保护作用。胆固醇对磷脂的相变具有双相调节作用。在相变温度以上时,胆固醇可抑制磷脂分子中脂肪酸烃链的旋转异构化运动,减少歪扭构象数量,从而降低膜的流动性;在相变温度以下时,胆固醇又可诱发磷脂分子的脂肪酸烃链产生歪扭构象变化,从而阻止胶晶态出现,减少刚性,增加柔韧性。胆固醇又有类似增塑剂样作用。在脂质体载体中提高胆固醇的比例可增加脂质体的稳定性,降低渗漏率。有报道,在制备脂质体时添加30-50%的胆固醇,可以极大的提高脂质体的载药量和稳定性。所以在脂质体中胆固醇必不可少。

2.胆固醇的理化性质

早在18世纪人们已从胆石中发现了胆固醇,1816年化学家本歇尔将这种具脂类性质的物质命名为胆固醇。胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇为白色粉末状固体,室温下稳定性较好,但对光敏感,因此应该避光、密封保存,保存得当,有效期可达5年。在三氯甲烷中易溶(1g/4.5ml),在乙醚中溶解(1g/2.8ml),在丙酮、乙酸乙酯或石油醚中略溶,在乙醇中微溶,在水中不溶(0.2mg/100ml)。

3.胆固醇的制造工艺

3.1动物组织提取

动物组织提取法是以新鲜动物内脏、骨髓及脑为原料,工艺为(1)浓缩提取:将猪牛羊脑子晒干粉碎放入浸泡罐提取,回收罐中回收,循环浸泡提取;(2)酸化:丙酮提取液滤出放入到反应罐中加入乙醇和硫酸加温酸化;(3)皂化:酸化的胆固醇过滤放入反应罐内加入乙醇和氢氧化钠加温皂化; (4)清洗:皂化后的胆固醇放入反应罐中加热,过滤,冷却结晶。此类工艺简单可行,是目前国内胆固醇的主要生产工艺,然而易受到原料供应的限制,且有残留致病基因的可能。

3.2羊毛脂提取

羊毛油脂是羊毛工业的副产品,羊毛油脂中胆固醇含量较高,约10%至15%,且成品低廉来源丰富,稳定性及安全性高,国外大部分胆固醇都是以羊毛脂为原料。但羊毛脂中的胆固醇多与羊毛脂酸结合以酯的形式存在,而且胆固醇类似物很多,所以要得到纯品,对技术要求很高。通过皂化工艺使胆固醇游离出来,皂化得到的胆固醇还含有大量的脱氢胆固醇、二氢胆固醇等类似物,因分子结构相似,性质相近,给分离带来困难,成为工艺难点和关键点。但是,随着对药品安全性的重视,羊毛脂来源的胆固醇必定会逐渐取代动物内脏来源的胆固醇。江西天新药业最新申请专利制备工艺如下:

(1)将羊毛脂、氧化钙、稀释剂、水及相转移催化剂混合,升温进行皂化反应,获得羊毛脂皂化产物;

 (2)从羊毛脂皂化产物中分离获得羊毛脂醇;

 (3)在水、乙醇、有机溶剂的存在下,使羊毛脂醇与氯化钙接触获得胆固醇氯化钙络合物;

 (4)将胆固醇氯化钙络合物进行解络,固液分离获得胆固醇粗品;

 (5)将胆固醇粗品与低级有机酸和低级醇混合溶剂混合,重结晶获得胆固醇成品。

4.胆固醇应该怎么选择

胆固醇可提高脂质体的稳定性,是制备脂质体不可或缺的物质。胆固醇辅料如何挑选,必须是已通过关联审评,注射级和高纯度。

艾伟拓代理的胆固醇,为日本进口,纯度高达99%,在国际上多个上市脂质体产品中长期应用。不同于大多数从动物内脏中提取胆固醇的工艺,艾伟拓供应的胆固醇采用的原料为羊毛脂,因此产品杂质相对较少,是脂质体研发和生产的最佳选择。DMF号:24780, EINECS号:200-353-2,备案登记号:F20170000106。

5.胆固醇在上市脂质体及工艺中的用法用量举例

制备普通载药脂质体,胆固醇(供注射用)是必须的添加物,用量一般为CHO:PC=0.3:1(摩尔比)。因PC和药物的不同,存在胆固醇的最佳用量。在一定范围内,脂质体的粒径、氧化稳定性、物理稳定性与胆固醇添加量成正相关,超出范围时,超过膜负荷,会造成部分脂质体破裂。另外,胆固醇的添加会对膜相变温度有一定影响,临界值以内使相变温度降低,临界值以上,使相变温度升高。形成脂质体结构时,胆固醇嵌插在磷脂双分子层上,因此可调节膜的流动性,作用随温度的不同而改变。在相变温度以上,它能使磷脂的脂肪酸链运动性减弱,从而降低磷脂分子的流动性;而在相变温度以下时,则可通过阻止磷脂脂肪酸链的相互作用,缓解低温引起的磷脂分子流动性剧烈下降。

胆固醇已广范应用于上市脂质体产品处方,并在多个临床阶段的脂质体项目中得以应用,如顺铂脂质体Lipoplatino ,多柔比星Doxil,两性霉素B AmBisome,柔红霉素DaunoXome,布比卡因EXPAREL,维替泊芬Visudyne等。

胆固醇用法用量举例如下:

5.1两性霉素B脂质体注射液(Ambisome,1990)

胆固醇用法:与磷脂和药物一起溶于有机溶剂,旋蒸、抽真空制膜。用量:52mg/瓶

5.2多柔比星脂质体注射液(Doxil, 1995)

胆固醇用法:注入法,与磷脂一起溶于有机溶剂,快速搅拌条件下缓慢匀速注入适当浓度的硫酸铵溶液。用量:3.19 mg/mL

5.3布比卡因脂质体注射液(Exparel, 2011)

胆固醇用法:与磷脂--起溶于有机溶剂,快速剪切条件下与含有布比卡因的水溶液混合、乳化形成初乳。用量:8.2mg/ml

6.在近期国内脂质体研发中的磷脂与胆固醇比例

查阅了近期国内脂质体研发报道,摘录制备工艺中磷脂与胆固醇比例举例如下:

谭李玉等制备了杜鹃兰酮脂质体,确定胆固醇与大豆磷脂质量比为1:8。

嵇晶等制备丹参总酚酸复合磷脂脂质体,磷脂与胆固醇质量比为3∶1。

屈晓梅等制备了舒马普坦脂质体,卵磷脂/胆固醇比5.4:1,。

张璐等制备了紫杉醇五味子乙素脂质体,磷脂44 mg、胆固醇8 mg。

王溪淼制备卡培他滨与奥沙利铂复方脂质体,磷脂与胆固醇之比为3:1。

邢宇等制备了银杏内酯B脂质体, 160 mg蛋黄卵磷脂、40 mg胆固醇。

王成祥等制备了盐酸阿霉素-黄芪甲苷脂质体,磷脂浓度为8 mg/mL,磷脂与胆固醇比为10∶1,药脂比为1∶5。

吕佳佳等制备紫杉醇/姜黄素双载药脂质体,磷脂浓度40 mg/mL,磷脂-胆固醇比4∶1,药脂比1∶40,水化介质为pH 6.5的PBS缓冲液。

胆固醇是脂质体制剂中的主要成分之一,对维持脂质体膜结构、稳定性等起重要作用。制备脂质体,必须选择通过关联审评,注射级和高纯度的胆固醇。现在胆固醇在脂质体制造中必不可少,但即将部分替代或全部替代。已有报道采用与胆固醇结构相似且具一定药理活性的甾醇、皂苷类化合物替代脂质体处方中胆固醇,同样能形成性质良好的脂质体。

参考文献:

1.《药剂辅料大全》罗明生 高天惠,四川科学技术出版社,2006年1月1日,第四十一章 脂质体载体材料

2.2015年 FDA Liposome Drug Products脂质体药物制药工业指南草案

3.中国药审中心:2005年10月20日细胞毒类抗肿瘤药脂质体制剂专题会会议纪要

4.中国药审中心关于脂质体、乳剂注册申报注意事项文章:审评三部 张宁  注册分类五中的特殊情况

5.中国药审中心2004年11月11日两个肿瘤药物脂质体品种的专家咨询会

6. 2020年AVT原辅料产品(供注射用)登记情况www.avt-avt.com

7. AVT:说说药用辅料中磷脂的发展历程是怎样的?www.avt-avt.com

8.董新电,徐勇智,王礼杰,英成浩,张先南,章根宝. 利用羊毛脂制备胆固醇的方法[P]. 江西省:CN111171098B,2021-05-07.

9. 谭李玉等人,杜鹃兰酮的合成及其脂质体制备研究,广州化工. 2021,49(16)

10. 嵇晶等人,丹参总酚酸复合磷脂脂质体制备工艺研究, 中南药学. 2021,19(06)

11. 屈晓梅等人,舒马普坦脂质体的处方与制备工艺优化,内蒙古医科大学学报. 2021,43(03)

12. 张璐等人,RPV修饰的紫杉醇与五味子乙素脂质体处方工艺优化及体外抗肿瘤活性初步评价,中国药房. 2021,32(10)

13. 王溪淼,锦州医科大学,卡培他滨—奥沙利铂复方脂质体的制备及体外细胞毒性研究

14. 邢宇等人,银杏内酯B脂质体的处方与制备工艺研究,中国现代应用药学. 2021,38(06)

15.王成祥等人,盐酸阿霉素-黄芪甲苷脂质体制备工艺研究,辽宁中医药大学学报. 2021,23(06)

16.吕佳佳等人,紫杉醇/姜黄素双载药脂质体的制备工艺及制剂学性质研究,遵义医科大学学报. 2020,43(03)

17.陈李霞等人,胆固醇在脂质体中作用及甾醇、皂苷对其替换的研究进展,中草药,2020年第51卷第24期