海藻糖在细胞冻存方面的应用研究（2）脂肪来源干细胞冻存

发布时间：2023-04-20

上一期，我们分享了海藻糖用于人源少突胶质前体细胞（OPC）冻存的相关研究文献，结论是冻存液中添加一定量海藻糖适用于人源少突胶质前体细胞（OPC）的长期冻存且有助于提高复苏活率。

本期，我们来了解一下海藻糖-甘油复合型冷冻保护剂（CPA）冻存脂肪来源干细胞（ADSCs）用于促进创面愈合的研究。

海藻糖-甘油复合型冷冻保护剂冻存脂肪来源干细胞在促进创面愈合中的研究

1. 脂肪来源干细胞（ADSCs）及其冻存保护剂

脂肪来源干细胞（ADSCs）具有分化为成脂、成骨及成软骨等中胚层来源细胞的潜能，同时还具有免疫抑制作用，在再生医学和难治性免疫紊乱的治疗方面具有临床应用前景，已成为医学界热门研究领域之一。

目前脂肪来源干细胞（ADSCs）治疗存在的问题之一就是其高效安全冻存问题。传统的冷冻保护剂（CPA）为10%二甲基亚砜（DMSO）+90%胎牛血清（FBS），但由于DMSO具有细胞毒性，可破坏组织的DNA甲基化过程，长期保存会增加细胞的死亡率，而FBS含有异种动物源性蛋白，可能会引入人畜共患病毒或可能导致过敏反应，因此该冷冻保护剂并不适合临床使用。

上海交通大学医学院附属第九人民医院的研究人员在前期体外试验发现，海藻糖联合甘油作为一种复合型CPA（1.0 mol/L海藻糖+20%甘油）在冻存脂肪来源干细胞后，在细胞活性、细胞增殖能力、细胞表面标志物表达及多向分化潜能上与传统CPA比较，差异无统计学意义，但迁移能力显著优于传统CPA。

研究人员通过构造小鼠创面模型，进一步探究了采用海藻糖-甘油复合型冷冻保护剂冻存脂肪来源干细胞复苏后，对体内生物学作用是否具有良好的表现。

2. 冷冻保护剂（CPA）的制备

①复合型CPA：1.0 mol/L海藻糖+20%甘油，溶剂为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。

②传统CPA对照组：10%DMSO+90%FBS。

③空白对照组：无任何冷冻保护剂。

CPA液体均在使用前配制，均经0.22μm孔径的滤网过滤。

3. 研究结果

①细胞活性和形态：

经过复合型CPA冻存的脂肪来源干细胞复苏后仍保持良好的细胞活性和形态。复合型CPA实验组的细胞活性对比传统CPA对照组及新鲜干细胞对照组，差异无统计学意义。三组的脂肪来源干细胞置于细胞培养箱中培养72h后，细胞形态基本保持一致。

②创面愈合速度：

建立小鼠创面模型，向创面分别注射经复合型CPA冻存的干细胞，新鲜干细胞，以及生理盐水。

在创面愈合第7天时，复合型CPA组的创面愈合率显著优于空白对照组，与新鲜干细胞组比较差异无统计学意义。

在创面愈合第14天时，三个组的创面愈合情况有相同趋势。

③对创面再上皮化和胶原沉积的影响

在创面愈合第14天时，复合型CPA组和新鲜干细胞组创面再上皮化更好，肉芽组织形成且胶原均匀、有序分布。即经过复合型CPA冻存的干细胞具有与新鲜干细胞相似的促创面再上皮化、胶原沉积的生物学功能。

④对血管生成能力的影响

CD31又称血小板-内皮细胞黏附分子，主要用于证明内皮细胞组织的存在及评估血管生成。通常对CD31进行免疫荧光染色来观察感染组织治疗过程中的血管生成情况。

创面愈合第7天和第14天，对创面组织进行CD31免疫染色，并进行定量统计。结果表明复合型CPA冻存的脂肪来源干细胞与新鲜干细胞均能有效促进血管生成。

4. 讨论

创面愈合是一个动态、复杂的病理过程，涉及到细胞、生长因子、细胞外基质、神经以及血管之间的相互协调。

脂肪来源干细胞（ADSCs）属于成体间充质干细胞的一种，可通过旁分泌多种细胞因子促进胶原沉积、组织血管化，并参与免疫调节机制，促进创面愈合。此外，脂肪来源干细胞可分化成上皮细胞，角质形成细胞和真皮成纤维细胞，直接促进创面愈合。

脂肪来源干细胞通常需要通过外科手术获取，但随着供者年龄的增大，脂肪来源干细胞的多向分化潜力会显著降低。假设可以对单次手术获取的年轻供者的脂肪来源干细胞冷冻保存，之后按需多次取用，就可以显著降低患者的治疗费用，同时降低干细胞供者年龄对治疗效果的影响。

该研究采用小鼠背部创面模型，对经过冻存复苏的脂肪来源干细胞和新鲜脂肪来源干细胞作用差异进行比较。结果显示，经过复合型CPA冻存复苏后的脂肪来源干细胞表现出与新鲜干细胞相同的促进创面愈合能力，1.0 mol/L海藻糖+20%甘油作为复合型冻存保护剂冻存脂肪来源干细胞，不会影响干细胞的体内生物学功能。

复合型冷冻保护剂可通过不同机制在冷冻过程中互补。

海藻糖作为一种非渗透性冷冻保护剂，分子量相对较小，可在细胞表面形成保护膜，减少对细胞的冷冻损伤。然而，海藻糖不能渗透细胞膜，限制了其保护效率。

甘油作为渗透性冷冻保护剂，通过增加溶液黏度，减少冰晶形成等方式起保护作用，同时，甘油可以帮助海藻糖穿透细胞膜以提高海藻糖的功效。

该研究表明，海藻糖+甘油作为一种安全、无毒的复合型冻存保护剂，不仅实现了脂肪来源干细胞活性的高效保存，还有效的保护了其生物学功能，确保其冻存复苏后具有与新鲜干细胞相同的促进组织再生效果，是一款极具临床转化前景的生物安全型干细胞冷冻保护剂。