乳佐剂分类
1.1 已上市乳佐剂
佐剂发展简图
1.1.1 MF59
MF59 是一种水包油乳佐剂，以角鲨烯（体积分数 4.5%-5.0%）为油相，两种非离子表面活性剂聚山梨酯 80（Tween80，质量体积分数 0.47%）和三油酸山梨坦（Span85，质量体积分数 0.47%）为乳化剂，分散于柠檬酸缓冲液中形成。角鲨烯（C30H50）是一种天然三萜烯烃，广泛存在于动植物中，MF59 所用角鲨烯提取自鲨鱼肝油；在人体内，它是类固醇激素生物合成的中间产物，也是胆固醇的直接前体。Tween80 和 Span85 均为天然脂肪酸衍生物（主要来源于植物），核心作用是稳定乳液：Tween80 的亲水亲油平衡值（HLB）为 15，Span85 的 HLB 为 1.8，两者组合可达到角鲨烯乳化所需的最佳 HLB，从而形成均一、稳定的乳剂。
1.1.2 AS03
AS03为水包油乳佐剂，油相由DL-α- 生育酚（质量体积分数4.7%）和角鲨烯（质量体积分数4.3%）组成，以非离子表面活性剂 Tween80（质量体积分数 1.94%）为乳化剂，分散于PBS（磷酸缓冲盐溶液）中。与 MF59相比，AS03的显著特点是添加了DL-α- 生育酚。生育酚是维生素E的异构体之一，在自然界分布广泛，也存在于人体肌肉、脂肪、肾上腺等组织中，具有抗氧化活性和免疫刺激特性，可防止脂膜氧化、维持细胞膜质量，并通过参与基因表达和细胞内信号传导调节免疫应答。需注意的是，AS03所用 DL-α-生育酚为人工合成，而非植物提取。由于角鲨烯含 6 个双键，极易氧化，DL-α- 生育酚的加入可降低其氧化程度，延长AS03的稳定性。
1.1.3 AF03
AF03是法国赛诺菲巴斯德公司开发的水包油乳佐剂，由角鲨烯（质量分数 32.5%）、Polyoxyethylene hexadecyl ether、Span80（质量分数 4.8%）、甘露醇（质量分数 6%）和 PBS 组成。其制备方法与 MF59、AS03 不同，采用相转变温度（PIT）乳化工艺：基于非离子表面活性剂Polyoxyethylene在水溶液中的相变特性，当水和油比例适当时，低温下可形成稳定的水包油乳剂；温度升高至相转变温度临界值时，转为油包水乳剂；温度降至PIT以下时，恢复为水包油乳剂。因此，保存温度对维持AF03的稳定性至关重要。
1.2 正在研发中的乳佐剂
1.2.1 稳定乳液（stable emulsion, SE）
SE 最初由美国 Edgar Ribi 公司开发，是一种水包油乳剂，由角鲨烯（体积分数 10%）、卵磷脂（质量分数 1.9%）、泊洛沙姆 188（质量分数0.091%）、生育酚（质量分数 0.05%）、甘油（体积分数 1.8%）分散于 25 mmol/L、pH 5.1 的磷酸铵缓冲液中形成。后经美国传染病研究所改进，调整角鲨烯含量至 2% 并去除了生育酚。单磷酰脂质 A（MPL）是脂多糖（LPS）的无毒衍生物，吡喃葡萄糖脂质 A（GLA）是 LPS 脂质 A 的六酰化衍生物，二者结构类似，常以 SE 为基质，形成 MPL-SE 或 GLA-SE 水包油乳佐剂。
1.2.2 W805EC NE
W805EC NE 是由美国 NanoBIO 公司开发的水包油乳佐剂，由大豆油（体积分数 13%-38%）、Tween80（3.55%）、乙醇（4.04%）、氯化十六烷基吡啶（0.64%）和水组成，平均粒径约 400 nm。由于氯化十六烷基吡啶是一种阳离子表面活性剂，可延长抗原在黏膜表面的停留时间并促进抗原穿透黏膜，因此W805EC NE相比其他水包油型乳佐剂更适用于黏膜给药途径。
1.2.3 Co vaccine?HT
Co vaccine?HT 由英国 BTG 公司开发，是一种水包油乳佐剂，由角鲨烷（体积分数 9.9%）、Tween80、蔗糖脂肪酸酯和 PBS 组成，平均粒径 130 nm。实验室数据显示，该佐剂在 4℃保存 4 年无显著变化，稳定性良好。
1.2.4 AS02
AS02 佐剂是 GSK 公司开发的含有免疫刺激剂 MPLA 和 QS21 的水包油乳化剂。AS02 佐剂与 Mtb 融合抗原 Mtb72F（为 M72 的前身）配伍的疫苗已经在不同动物模型中进行了测试。REED等在食蟹猴模型中证实了 Mtb72F/AS02 疫苗对预防 Mtb 感染具有保护作用。Mtb72F/AS02 疫苗Ⅰ 期临床试验结果显示，接种者体内产生高水平的抗原特异性体液免疫应答和强烈的 CD4+ T 细胞免疫应答，且持续期在 1 年以上。目前 AS02 佐剂主要应用于疟疾疫苗，其研究结果显示 AS02 佐剂安全性高，接种者无明显不良反应，表明 AS02 佐剂不仅适用于结核疫苗，也有应用于其他疫苗的潜力。
1.2.5 Pickering乳状液
作为疫苗佐剂使用的Pickering乳状液是一种微凝胶（明矾）稳定的水相角鲨烯乳状液。它与传统表面活性剂乳状液的主要区别在于系统不含有表面活性剂，而是使用具有一定亲水性和亲脂性的纳米颗粒作为乳状液稳定剂。通过调整颗粒属性和油水相参数，通过超声处理获得了颗粒稳定的乳状液。Pickering乳状液具有无表面活性剂、毒性低和稳定性高的优点。它们在食品、制药和化妆品行业中有广泛的应用。
一些研究表明，Pickering乳状液作为SARS-CoV-2疫苗佐剂增强对新型冠状病毒的体液免疫是很有前景的。明矾佐剂比树突状细胞(DC)更粘附于细胞膜，导致缺乏细胞内转移和抗原处理，从而限制了Th1细胞介导的细胞免疫反应。为了解决这个问题，明矾通过水相角鲨烯吸附，形成明矾稳定的Pickering乳状液(PAPE)。由于其主要成分明矾和角鲨烯，PAPE具有良好的生物安全概况。
此外，由于明矾在油/水界面的密集排列，PAPE不仅吸附大量的SARS-CoV-2抗原，而且Pickering乳状液对DCs具有更高的亲和力，从而触发了所传递抗原的摄取和交叉呈递。由于T细胞的激活取决于抗原的数量，APCs可以吸附和呈递更多的抗原，激活更多的T细胞，特异性细胞免疫反应就越明显。在没有表面活性剂的情况下，Pickering乳状液的微米级颗粒和粗糙的表面形态为抗原吸附和细胞相互作用提供了大的比表面积，允许更有效的抗原积累。此外，PAPE组诱导的抗原特异性抗体滴度比铝佐剂组高6倍以上，IFN-γ分泌T细胞多3倍，表明有效激活了体液和细胞免疫。
与MF59佐剂类似，Pickering乳状液的佐剂效应是由于油包水乳状液配方，且没有任何单一成分诱导类似佐剂的效应。由于明矾颗粒的存在，Pickering乳状液在注射部位形成抗原池，大约在注射后三天内，然后吸引DC细胞浸润和抗原摄取。根据现有文献，通过血清中的免疫病理学评估Pickering乳状液作为佐剂的安全性和疫苗相关组织损伤；在给药后几天内注射部位未检测到显著副作用，也未检测到细胞因子风暴的产生。然而，这些评估只是初步测试，证明了PAPE的佐剂属性和安全性。尽管与Pickering乳状液中的明矾剂量相关的副作用目前有限，但铝的临床神经毒性是否会影响PAPE的广泛使用需要进一步研究。
1.2.6 Syntex佐剂配方（SAF）
SAF是一种含角鲨烷为油相的油包水乳状液，由Syntex在1980年代开发，旨在减少以矿物油为油相的CFA(W/O)乳状液的毒性，同时仍诱导有效的细胞介导的免疫反应。在PBS（pH 7.4）中，添加胞壁酰二肽之前SAF的最终组成为5% w/v角鲨烷，2.5% w/v普朗尼克L121，和0.2% w/v Tween 80。与抗原和/或胞壁酰二肽混合并稀释原液两倍后，获得这些组分的最终注射浓度。SAF的平均粒径为150-160 nm。SAF乳状液（在添加细胞壁酰二肽之前）非常稳定，即使在冷冻条件下，也可以在室温下保存六年而不会被破坏。SAF乳状液刺激Th1细胞介导的免疫反应，主要表现为IgG2a抗体水平增加和细胞因子IFN-γ分泌增加。SAF还激活替代补体途径作为另一种可能的辅助作用机制。许多不同的抗原与SAF结合使用，并显示出良好的免疫活性。SAF对人体的肌肉刺激性很小，但在临床试验中显示出高度的反应性；因此，它不再作为免疫佐剂产品使用，这可能与添加胞壁酰二肽有关。
1.2.7 DETOX
DETOX的成分包括细菌细胞壁骨架(CWS)和角鲨烷(1%)中的单磷酸脂A(MPL)和Twain 80(0.2%)的制剂。DETOX，也称为Melacine，具有良好的佐剂活性，并已获批准作为治疗性黑色素瘤疫苗。然而，DETOX佐剂的副作用是明显的；它们在注射部位反应性高，并可导致局部肉芽肿的形成。
1.2.8 PROVAX
PROVAX是一种由IDEC Pharmaceuticals开发的角鲨烷乳状液，其配方与SAF类似，但在注射时将Pluronic L121的浓度降低到1.25% w/v，并去除了酰二肽。PROVAX是一种三倍浓缩物，由15% w/v角鲨烷、3.75% w/v Pluronic L121和0.6% w/v Tween 80组成，可以诱导抗体和细胞毒性T细胞。
开发关键点分析
乳佐剂的开发需在免疫增强效能、安全性及实际应用可行性之间实现精准平衡，其核心在于通过成分优化和工艺及质量控制，构建既能高效激活免疫应答，又能最大限度降低不良反应的乳液体系。以下从关键维度展开分析：
2.1 核心成分的科学筛选
成分是乳佐剂性能的基础，需兼顾免疫活性、生物相容性及稳定性：
油脂相的精准选择：需优先采用生物可降解或天然存在的油脂（如角鲨烯、植物源甘油三酯），替代传统弗氏佐剂中的矿物油（如石蜡油）。这类油脂不仅能减少体内长期沉积引发的肉芽肿风险，还可通过调控碳链长度（如 C16-C18 饱和脂肪酸）和饱和度，优化抗原缓释速率与免疫细胞吞噬效率。例如，MF59 佐剂选用角鲨烯作为油相，其与人体皮脂成分相似，生物相容性已通过数十年临床验证。
表面活性剂的配伍优化：以非离子型表面活性剂（如聚山梨酯 80、司盘 85）为主，避免离子型表面活性剂（如硬脂酸铝）可能引发的局部炎症。需通过复配比例调整，稳定油-水界面张力，同时确保与抗原分子的兼容性，避免表面活性剂破坏蛋白质抗原的二级结构（可通过圆二色谱法验证）。
免疫刺激物的协同整合：在水包油乳剂体系中精准添加免疫增强分子（如 TLR4 激动剂 MPL、CpG 寡核苷酸），通过 “depot 效应 + 模式识别受体激活” 的双重机制提升免疫应答。需注意控制添加浓度，例如 MF59 未添加额外免疫刺激物却能通过油相本身激活免疫，而 AS03 则通过DL-α- 生育酚与角鲨烯的协同增强 Th1 型免疫。
合适的缓冲体系：如MF59中的柠檬酸缓冲液稳定体系的pH和角鲨烯含量。研究表明，在常温储存条件下，未添加柠檬酸缓冲液的乳液中，pH值和角鲨烯含量会随时间显著下降。而添加柠檬酸缓冲液后，可有效抑制角鲨烯的氧化反应，同时稳定乳液的pH值和角鲨烯含量，从而提高佐剂的储存稳定性。
2.2 MF59生产工艺及中间品控制要点
MF59佐剂的生产工艺
粗乳制备需首先制备两相，即油相（角鲨烯和三油酸山梨坦）和水相（聚山梨酯80与柠檬酸缓冲液）。两相混合后经连续剪切和“倒罐”剪切技术制备粗乳，利用均质机产生的湍流、空化和机械剪切将粗乳液的粒径控制在5000 nm以下。粗乳稳定性受剪切方式、流速、剪切线速度及温度等因素影响，生产过程中应研究优化剪切条件，合理控制流速和温度，确保粗乳稳定。
微流化是MF59佐剂生产的核心步骤，通过进一步减小粒径和提高乳液均匀性制备稳定的纳米乳液。粗乳在高压条件下经微流化装置的相互作用室（通常为Ｙ型腔或Ｚ型腔），利用液压剪切、冲击、磨损、强湍流和气蚀作用，将粒径显著减小，通常使乳液中的油滴平均粒径小于220 nm，从而形成均匀纳米乳液。在微流化过程中，粗乳可以在设备中多次循环，直至达到所需的粒径和分散性。微流化的主要控制参数包括压力、循环次数及温度，这些参数直接影响乳液的粒径和均匀性。根据实际生产，如果粗乳需保存，应开展稳定性研究以确定合适的保存条件及时间，并重点关注粒径变化和细菌内毒素的控制，以确保产品的质量和安全性。
过滤是MF59佐剂生产的关键步骤之一，用于去除残留的大油滴并进一步提高乳液的均匀性和稳定性。乳液经微流化处理后，通过双层过滤器进行过滤，以防止大油滴在后续储存过程中成为聚集点，从而引发乳液降解。经微流化和过滤处理后的 MF59佐剂，应控制乳液的平均粒径和尾端大颗粒（1.2-400 μm）的数量以满足质量标准和应用要求。此外，应关注MF59佐剂的无菌控制，合理设置无菌过滤工艺。
对于MF59佐剂的疫苗成品配制，需根据抗原的稳定性选择配制方式。部分疫苗抗原在与角鲨烯乳剂佐剂配制和储存时表现出不稳定性，对此可结合研究情况，考虑将抗原和佐剂分别包装在单独的小瓶中。而对于已证明在角鲨烯佐剂存在下具有长期稳定性的抗原，可直接制备为单瓶制剂。
2.3 MF59质量特性研究及质量标准
MF59佐剂的质量特性研究应结合实际生产工艺和预期产品特性,系统开展研究，并在此基础上建立科学合理的质量标准。
MF59佐剂的常规理化指标包括外观、鉴别、pH、渗透压及黏度、无菌等，其外观应为均匀的白色液体，无可见异物，pH值应为中性。鉴别可通过对角鲨烯的鉴别实现，其余指标控制可参考《中华人民共和国药典》研究制定。
MF59佐剂中主要成分角鲨烯、聚山梨酯80和三油酸山梨坦的含量是佐剂的关键质量属性，是生产过程及质量放行中的重要监测指标。根据《中华人民共和国药典》《美国药典》（USP）及相关研究文献，角鲨烯含量可采用气相色谱法测定，而聚山梨酯80和三油酸山梨坦的含量可通过高效液相色谱法检测。
粒径及粒径分布是纳米乳佐剂的关键质量属性，对佐剂的免疫效力和稳定性具有直接影响。以角鲨烯为主要成分的水包油佐剂中，粒径对免疫效力的影响尤为显著。研究表明，乳滴大小显著影响免疫反应的强度。小粒径乳滴更容易被细胞吸收，进而引发更强的免疫应答，相比粒径较大的佐剂，可诱导更高的抗体效价。此外，粒径较小的乳液更易进入淋巴细胞，从而减轻局部炎症并减少注射部位形成油库的风险。粒径的测定通常采用动态光散射（DLS）技术，可准确检测粒径及分散系数（PDI）。MF59佐剂的粒径应严格控制，且PDI应小于0.3。对于尾端大颗粒（粒径1.2-400 μm）的检测，可采用基于单粒子光学传感技术的光阻法（LE/SPOS），MF59佐剂的尾端大颗粒数量应严格控制在1×107颗粒·mL-1以下。在实际生产和研究过程中，粒径及其分布不仅作为生产中间品监测和质量控制的重要指标，也是佐剂及疫苗成品放行和稳定性考察的关键项目，需进行严格控制，以确保佐剂和疫苗产品的质量、效力及长期稳定性。
乳液的稳定性表征研究可从乳剂/乳滴的完整性、融合效应及破乳效应等方面展开系统分析。可基于以下项目开展研究，包括大颗粒数、分层检查、离心稳定性常数（Ke）、Turbiscan稳定性、乳滴合并速度、乳液表面张力及表面电荷等。佐剂与抗原的相互作用研究方面，可借助多种先进技术进行深入探索。例如：采用Turbiscan稳定性分析评估体系的物理稳定性，利用液相原位透射电子显微镜（LPTEM） 观察乳液纳米结构的动态变化，通过SEC?HPLC、傅里叶红外光谱法、荧光光谱法及等温滴定量热法等方法解析佐剂与抗原间的分子相互作用机制。
艾伟拓作为药用辅料供应商，始终聚焦高端制剂市场需求，致力于为中国制药企业提供优质、安全的药用辅料解决方案。为疫苗研发客户提供以下核心产品：
QS-21， CAS号：141256-0404 ，CDE登记号F20250000075
QS-7，CAS号：208933-54-4
QS-17
QS-18
QS-ANM
MF59
CpG ODN1018(HP) ，CAS号：937402-51-2
CpG ODN7909(HP)
CpG ODN9008(HP)
